سامانه پژوهشی – رابطه بین فعالیت آنزیم های زنجیره تنفسی و بازدهی خوراک در بره های نر قزل …

۳-۲-۳-۳- اندازهگیری فعالیت مجموعه آنزیمی III (یوبیکویینول سایتوکروم c ردوکتاز)

یوبیکویینون احیا شده (یوبیکویینول[۵۲]، QH2) بهوسیله Cox I و Cox II، الکترون را به‎کمک Cox III به سایتوکروم c انتقال میدهد. مجموعه آنزیمی III دارای ۱۱ زیر واحد پروتینی است که سه پروتین انتقال دهنده الکترون شامل سایتوکروم c1، پروتین با هسته آهن-سولفور و سایتوکروم b را در بر دارند. سایتوکروم b از دو گروه هِم bL و bH (b562 و b566) تشکیل شده است. در دو گامه واکنشهای اکسایش و کاهشِ یک ملکول QH2 (چرخهی Q)، دو ملکول سایتوکروم c1 و در نتیجه دو ملکول سایتوکروم c احیا میشوند و همزمان، چهار پروتون (H+) به فضای بین دو غشا فرستاده میشود (نگاره ۳-۶). آنتی مایسین A که فعالیت این مجموعه آنزیمی را مهار می‎کند، برای اندازهگیری احیای غیر آنزیمی سایتوکروم c[53] بهکار می رود (Pon, 2001 Schon and).
QH2+Cyt c1 (oxidized) → QH2+•Q+2H+N+Cyt c1(oxidized)→
Q + ۲H++ Cyt c1(reduced) QH2+2H+P+Cyt c1 (reduced)
QH2+2 cyt c1(oxidized)+2H+N→Q+2 cyt c1 (reduced)+ 4 H+P
نگاره ۳-۶: ساختار و کنش Cox III در زنجیره انتقال الکترون و چرخه Q (Lehninger, 2004).
در این آزمایش، ارزیابی فعالیت مجموعهی آنزیمی III زنجیرهی تنفسی در دو گامه انجام شد. گامه اول، شامل تهیه یوبیکویینول ۲ از یوبیکویینون ۲ بود و در گامه دوم، فعالیت آنزیم با اندازهگیری افزایش مقدار جذب نور در طول موج ۵۵۰ نانومتر در جریان اکسید شدن یوبی‎کویینول ۲ تعیین شد.

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت zusa.ir مراجعه نمایید.

۳-۲-۳-۳-۱- احیا کردن یوبیکویینون۲

برای احیا کردن یوبیکویینون۲، روش پومفری و ردفیرن مورد استفاده قرار گرفت Pumphrey and Redfearn, 1960) ). نخست، محلولی دارای یک میلیگرم یوبی‎کویینون۲ در یک میلیلیتر اتانول تهیه شد. سپس پنج میلی گرم سدیم بروهیدرات به ۵۰۰ میکرولیتر از محلول یوبیکویینون افزوده و بهطور کامل حل شد. برای شفاف کردن محلول، از ۱۰ میکرولیتر HCl غلیظ استفاده شد.

۳-۲-۳-۳-۲- اندازهگیری فعالیت آنزیم یوبیکویینول سایتوکروم c ردوکتاز

الف) محلولهای آبی KH2PO4 (۱۰۰ میلیگرم در میلیلیتر، ۵/۷=pH)، MgCl2 (۱۰ میلیگرم در میلیلیتر)، BSA (10 میلیگرم در میلیلیتر) و KCN (یک میلیگرم در میلیلیتر) و محلولهای اتانولی روتنون (یک میلیگرم در میلی‎لیتر)، سایتوکروم c (یک میلیگرم در میلیلیتر) و آنتی مایسین A (10 میلیگرم در میلی‎لیتر) تهیه شدند.
ب) ده تا ۲۰ میکروگرم پروتین میتوکندریایی (۱۰ میکرولیتر از محلول میتوکندری جداسازی شده) برای ۳۰ ثانیه به محلول واکنشی دارای ۳۵ میلی‎مولار KH2PO4، ۵ میلیمولار MgCl2، ۵/۲ میلیگرم در میلیلیتر BSA، ۸/۱ میلی‎مولار KCN، ۱۲۵ میکرومولار سایتوکروم c و ۱۰ میکروگرم در میلی‏لیتر روتنون در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد افزوده شد.
پ) کیووت دارای محلول در اسپکتروفتومتر گذاشته شد و مقدار جذب نور برای طول موج ۵۵۰ نانومتر، صفر شد.
ت) با افزودن ۸/۳۱ میکرومولار یوبیکویینول ۲ و مخلوط کردن کامل آن با محلول واکنشی به‏وسیله پیپت کرد،ن واکنش آغاز شد.
ث) سه دقیقه پیش و پس از افزودن ۱۰ میکروگرم در میلیلیتر آنتی مایسین A، مقدار جذب نور خوانده شد. شایان توجه است که در این مدت، مقدار جذب نور درپی افزایش غلظت سایتوکروم c احیا شده، افزایش پیدا میکند.
ج) با استفاده از ضریب جذب mM-1cm-1 ۲/۱۹ (Sandelin, 2005) مقدار فعالیت آنزیم برای یک میلیگرم پروتین میتوکندریایی محاسبه شد.

۳-۲-۳-۴- اندازهگیری فعالیت مجموعه آنزیمی IV (سایتوکروم c اکسیداز)

در گامه پایانی زنجیره انتقال الکترون، Cox IV الکترون را از سایتوکروم c به اکسیژن مولکولی (O2) برای تولید آب منتقل میکند. مجموعه آنزیمی IV، یک آنزیم بزرگ با ۱۳ زیر واحد پروتینی است. زیر واحد II از دو یون مس پیوند شده با گروههای –SH از دو اسیدآمینه سیستیین تشکیل شده است. این مرکز دو هستهای[۵۴] (CuA) همانند مراکز ۲Fe-2S در پروتین‎های دارای آهن-سولفور است. زیر واحد I، دو گروه هِم a و a3 و یک یون مس (CuB) را در بر می گیرد. هِم a3 و CuB نیز یک مرکز دوهسته ای دیگر را تشکیل می دهند که پذیرنده الکترون از هِم a و انتقال دهنده آن به O2 است. الکترون نخست از سایتوکروم c به مرکز CuA و سپس به هِم a و پس از آن به مرکز CuAa3 منتقل میشود. در پایان، الکترون به اکسیژن ملکولی داده شده و همراه با دو H+ در ماتریکس میتوکندری، آب تولید میشود. از هر دو ملکول سایتوکروم c اکسید شده، یک ملکول آب تولید و دو پروتون (H+) به فضای بین دو غشا پمپ میشود (Lehninger, 2004) (نگاره ۳-۷).
نگاره ۳-۷: ساختار و کنش Cox IV (Lehninger, 2004).
فعالیت سایتوکروم c اکسیدازی مجموعه آنزیمی IV، درپی کاهش مقدار جذب نور در طول موج ۵۵۰ نانومتر در اثر اکسیداسیون ساتیوکروم c احیا شده اندازهگیری شد. این آزمایش در دو گامه شامل احیای سایتوکروم c و ارزیابی اسپکتروفتومتری فعالیت آنزیم انجام شد.
الف) احیای سایتوکروم c
پنجاه میکرو مولار سایتوکروم c در ۱۰۰ میکرولیتر محلول ۱۰۰ میلی مولار Tris-HCl حل و ۱۰۰ میکرولیتر دیتیونایت سدیم[۵۵] بهآن افزوده شد. برای تعیین خلوص سایتوکروم c احیا شده، مقدار جذب نور در طول موجهای ۵۵۰ و ۵۶۵ نانومتر برای محلول، اندازهگیری و نسبت مقدار جذب نور در طول موج ۵۵۰ به ۵۶۵ نانومتر (A550/A565) محاسبه شد. در این آزمایش نسبت A550 به A565، ۱/۲۲ (۶۳۴:۲۹) به‏دست آمد و درصد خلوص سایتوکروم c احیا شده، ۶۹/۹۵% بود.
ب) اندازه گیری فعالیت آنزیم
ده تا ۲۰ میکروگرم پروتین میتوکندریایی به ۱۰ میلیمولار KH2PO4 (۷=pH) افزوده و برای ۳ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شد. مقدار جذب نور در طول موج ۵۵۰ نانومتر برای محلول صفر شد. واکنش، با افزودن ۵۰ میکرومولار محلول سایتوکروم c احیا شده، آغاز و کاهش جذب نور پس از ۹۰ ثانیه اندازهگیری شد. با استفاده از ضریب جذب mM-1cm-1 ۲۱ (Sandelin, 2005) و غلظت پروتین نمونه، فعالیت آنزیمی Cox IV بر حسب واحد در یک میلیگرم پروتین محاسبه شد.

۳-۲-۳-۵- اندازهگیری فعالیت مجموعه آنزیمی V (ATP سینتاز)

مجموعههای آنزیمی I، III و IV همراه با انتقال الکترون در زنجیره تنفسی، پروتون را به فضای بین دو غشا میفرستند و سبب افزایش شیب غلظت پروتون میشوند. این شیب غلظت بهعنوان انرژی مورد نیاز برای ساخت ATP بهکار میرود. در میتوکندری، ATP سینتاز که مجموعه آنزیمی V نیز نامیده میشود، دو زیر مجموعهی F0 و F1 و هم‏چنین دو کنش مختلف دارد. زیر مجموعهی F0 که از سه زیر واحد a، b و c با نسبت ab2c10-12 تشکیل شده است، درون غشای داخلی میتوکندری قرار دارد و یک کانال پروتون را بهوجود میآورد که پروتون از راه آن به ماتریکس برگردانده میشود. در بخش ماتریکسی ATP سینتاز، زیر مجموعهی F1 قرار دارد که از دو زیر واحد α و β تشکیل شده و به وسیله زیر واحدهای ε و γ به F0 چسبیده است. انتقال پروتون ها از F0 سبب چرخش آن و تولید ATP در F1 میشود (نگاره ۳-۸).
F000
F1
نگاره ۳-۸: ساختار، زیر مجموعهها و زیر واحدهای ATP سینتاز میتوکندریایی (Lehninger, 2004).
در این حالت، آرایش فضایی زیر واحدها در F1 تغییر میکند بهطوری که محور از یک زیر واحد که بهطور محکمی به ATP پیوند دارد به زیر واحدی که سبب آزاد شدن ATP و پیوند ADP و Pi میشود، چرخش کرده و تشکیلATP دیگری را امکان پذیر میکند. واکنش ADP+Pi↔ATP+H2O یک واکنش برگشت پذیر است که در حالت عکس، یعنی تولید ADP و Pi از ATP نیاز به نیروی محرکه پروتونی ندارد (Lehninger, 2004).
فعالیت حساس به الیگومایسین ATP سینتاز میتوکندری در جریان کاهش NADH به وسیله آنزیم‎های لاکتات دهیدروژناز و پیروات کیناز در طول موج ۳۴۰ نانومتر اندازهگیری شد (نگاره ۳-۹). مقدار ۱۰ تا ۲۰ میلیگرم پروتین برای ۳۰ ثانیه درون محلول واکنشی حاوی ۵۰ میلی مولار Tris-HCl (8=pH)، ۲۰ میلی مولار MgCl2، ۱۵ میکرومولار Carbonyl m-chlorophenylhydrazone cyanide، ۵ میکرومولار آنتی مایسین A، ۱۰ میلی‎مولار Phosphoenolpyruvate، ۵/۲ میلیمولار ATP، ۲۰ واحد لاکتات دهیدروژناز، ۲۰ واحد پیروات کیناز، یک میلیمولار NADH و ۵ میلیگرم در میلیلیتر BSA در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوباسیون شد. کاهش جذب نور در طول موج ۳۴۰ نانومتر، سه دقیقه پیش و پس از افزودن ۳ میکرومولار الیگومایسین، اندازهگیری شد. با استفاده از ضریب جذب mM-1cm-1 ۲۲/۶ (Sandelin, 2005) و غلظت پروتین، فعالیت Cox V برای هر نمونه محاسبه شد.
 
نگاره ۳-۹: مسیرهای واکنشی در اندازهگیری فعالیت Cox V ((Lotscher et al., ۱۹۸۴٫

۳-۳- تجزیهی آماری

در آغاز، بره‌ها به دو دسته ۱۱ تایی FCR)، aFCR و RFI بالا و پایین) با یک واحد انحراف معیار نسبت به میانگین همه بره‌ها (۲۹ بره) بین دو دسته بالا و پایین، دسته‌بندی ‌شدند. همبستگی بین فعالیت مجموعه‌های زنجیره تنفسی و روش‌های برآورد بازدهی خوراک، با داده‌های به دست آمده از همه بره‌ها، آنالیز شد. در پایان داده‌ها با نرم‌افزار SAS 9.1 (2002) و آزمون‌های همبستگی پیرسون و آزمون t-test ارزیابی شدند. به سبب تفاوت در وزن آغازین بین گروههای FCR، وزن بدن بهعنوان کوواریت در نظر گرفته شد.

فصل چهارم

یافتهها

۴-۱- بازده مصرف خوراک

میانگین فراسنجههای وابسته به روش‌های بازدهی خوراک، در جدول ۴-۱ نشان داده شده است. در شرایط یکسان، برهها از لحاظ بازدهی خوراک (RFI، FCR و aFCR) در دو گروه متفاوت قرار گرفتند (P<0.01). بین دو گروه RFI، تفاوت معنی‌داری بین FCR و aFCR و بین دو گروه FCR و aFCR، تفاوت معنی‌داری برای RFI وجود نداشت. اما بین دو گروه aFCR (یا FCR)، تفاوت معنی‌داری برای) FCR یا (aFCRوجود داشت. پس‌مانده خوراک مصرفی با وزن متابولیکی و میانگین افزایش وزن روزانه همبستگی معنی‌داری نداشت، ولی همبستگی متوسطی (۵۶/۰= r) با میانگین مصرف خوراک داشت (نگاره ۴-۱).
نگاره ۴-۱: همبستگی پسماندهی خوراک مصرفی ((RFI با میانگین وزن متابولیکی بدن (▲)، میانگین افزایش وزن روزانه (■) و میانگین خوراک مصرفی روزانه (●).
جدول ۴-۱: میانگین وزن آغازین (Initial BW)، وزن پایانی (Final BW)، وزن متابولیکی (MBW)، میانگین افزایش وزن روزانه (ADG)، میانگین مصرف خوراک روزانه (ADFI)، پسمانده خوراک مصرفی (RFI)، نسبت تبدیل خوراک (FCR) و نسبت تبدیل خوراک تصحیح شده (aFCR) در برههای گروهبندی شده، بر پایه پس مانده خوراک مصرفی (RFI)، نسبت تبدیل خوراک (FCR) و نسبت تبدیل خوراک تصحیح شده (aFCR).