مقاله علمی با منبع : رابطه بین فعالیت آنزیم های زنجیره تنفسی و بازدهی خوراک در بره های نر …

الف
ب
نگاره ۳-۲: الف- نمونهبرداری از ماهیچه (بیوپسی)، ب- بخیه ساده پس از نمونه‎برداری.

۳-۱-۳- نمونه گیری از ماهیچه دوسر ران (پس از کشتار)

پس از کشتار، برهها در مدتی کمتر از ۵ دقیقه بهسرعت پوستکنی شدند، یک نمونه ۳۰-۲۰ گرمی از ماهیچه دوسر ران (پای راست) جدا پس از زدودن خون سطحی (با استفاده از کاغذ)، چربیهای سطحی از ماهیچه جدا شد. آنگاه نمونه‎ در نیتروژن مایع یخ زده، و در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شد.

۳-۲- اندازهگیریهای آزمایشگاهی

جداسازی، تعیین غلظت میتوکندری و اندازهگیری فعالیت مجموعههای آنزیمی زنجیره تنفسی میتوکندری در پژوهشکده زیست فنآوری دانشگاه شیراز انجام شد. بیشتر مواد شیمیایی از شرکت (Co., St. Louis, MO, Inc) Sigma-Aldrich و تعداد اندکی مواد شیمیایی (اتانول و فسفریک اسید) از شرکت Merck (Co, Whitehouse, NJ.) خریداری شدند.

۳-۲-۱- جداسازی میتوکندری

در بسیاری از موارد برای بررسی کنش و ساختار یک اندامک، لازم است آن را از سیتوزول و اندامکهای دیگر جدا کرد. یکی از روشهای جداسازی اندامکها، جداسازی بر پایه تفاوت در اندازه و نرخ تهنشینی اندامکها است که با روش سانتریفیوژ کردن افتراقی[۴۱] انجام میشود (Lehninger, 2004). جداسازی میتوکندری در دو گامهی سانتریفیوژ انجام میشود. در گامه اول (سرعت پایین، g 1000-800) اندامکهای بزرگتر مانند هسته و لاشه سلول و در گامه دوم (سرعت بالا، g 15000-10000)، میتوکندریها تهنشین میشوند. البته ممکن است همراه با میتوکندریها، اندامکهای دیگری مانند گرانولهای تراوشی و کیسههای گلژی (بیشتر در غدد درون‎ریز و برونریز) لایزوزومها (در جگر، کلیه، طحال، لوکوسیتها و ماکروفاژها) و پراکسی‎زوم‎ها (بیشتر همراه با میتوکندری جدا شده از بافت جگر) نیز تهنشین شوند که برای خالصسازی میتوکندری، از سانتریفیوژ شیب غلظت[۴۲] استفاده میشود (Pon and Schon, 2001). در بیشتر پژوهشها، برای بررسی میتوکندری سلولهای ماهیچه‎ای، تنها از سانتریفیوژ افتراقی، برای جداسازی استفاده شده است (Bottje et al., ۲۰۰۲). پیشاز انباشت میتوکندری، غشای پلاسمایی و پیوندهای بین سلولی با روش آنزیمی (Protease K) Kolath, 2006)) و مکانیکی (همگن سازی نرم به کمک هموژنایزر با هاون تفلن) تخریب می‎شوند.
در این آزمایش، جداسازی میتوکندریها از ماهیچه دو سر ران با روش کولاس Kolath, 2006)) و با اندکی تغییر انجام شد. به ازای هر نمونه، ۲۰ میلیلیتر محلول I (100 میلی مولار Sucrose، ۱۰۰ میلی مولار Tris-HCl، ۴۶ میلی مولار KCl و ۱۰ میلیمولار EDTA با ۴/۷= pH) تهیه شد. نمونههای پنج گرمی گوشت از یخچال oC80- خارج و درون ۱۰ میلی لیتر محلول I سرد شده در یخ، انداخته شد. پس از یخگشایی، نمونهها با قیچی تکه تکه و برای پنج دقیقه درون ۵ میلی لیتر محلول I دارای ۵ میلیگرم Protease K در دمای اتاق قرار داده شدند. محلول دارای نمونه برای دو دقیقه با هموژنایزر با هاون تفلن، همگن و برای ۵ دقیقه دیگر درون یخ نگهداری شد. سپس محلول همگن شده، بهدرون میکروتیوب ۵/۱ میلیلیتری ریخته شد و برای ۱۰ دقیقه در دور g1000 و دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد (Sigma centrifuge, model: 1-15pk, UK). پلت تشکیل شده که دارای بقایا و لاشه سلول بود، دور ریخته شد و محلول باقیمانده برای جداسازی میتوکندریها به مدت ۱۵ دقیقه در دور g 10,000 و دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. دراین فاصله زمانی، محلول شستشو (محلول I دارای ۵/۰ درصد BSA[43]) آماده شد. در پایان گامه دوم سانتریفیوژ کردن، پلت تشکیل شده که دارای میتوکندریها بود نگه داشته شد و مایع رویی، دورریخته شد. پلت میتوکندریها، با یک میلی‎لیتر محلول شستشو و با پیپت کردن، شستشو شد و برای تهنشین شدن دوباره میتوکندریها، برای ۱۵ دقیقه دیگر در دمای ۴ درجه سانتی گراد و دور g 10,000 سانتریفیوژ شد. در این مدت، بهازای هر نمونه، ۲ میلی لیتر محلول II، (دارای ۲۳۰ میلی مولار Mannitol، ۷۰ میلی مولار Sucrose، ۲۰ میلی مولار Tris-HCl، ۵ میلی مولار KH2PO4 و با ۴/۷=pH) ساخته شد. پساز آخرین گامه سانتریفیوژ، محلول رویی تخلیه و پلت بدون بههم خوردن، با یک میلی لیتر از محلول II به آرامی شستشو شد. با پیپت کردن ۱ میلیلیتر محلول II، میتوکندریها درون محلول بهطور کامل معلق شدند. پس از مخلوط کردن کامل میتوکندریها درون محلول، ۵۰ میکرولیتر از محلول برای اندازه‎گیری غلظت میتوکندری بهصورت جداگانه در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد و باقیمانده نمونههای میتوکندری، به سرعت در نیتروژن مایع منجمد و در دمای oC80- (فریزر ژال تجهیز، ایران) نگهداری شدند.

برای دانلود فایل متن کامل پایان نامه به سایت ۴۰y.ir مراجعه نمایید.

۳-۲-۲- اندازهگیری غلظت پروتین میتوکندریایی[۴۴]

برای تعیین غلظت میتوکندری، غلظت پروتین، اندازهگیری میشود و بهصورت غلظت پروتین میتوکندریایی بیان میشود. فعالیت آنزیمی، بر پایه مقدار پروتین میتوکندریایی (واحد/میلی گرم پروتین میتوکندریایی) محاسبه میشود Pon and Schon, 2001)).
روش Bradford یک روش رنگ سنجی برای اندازهگیری غلظت پروتین است که به‏سبب سادگی و حساسیت بالا، کاربرد زیادی دارد. اساس این روش، تغییر بیشینه جذب برای محلول اسیدی Coomassie blue G-250 از ۴۶۵ نانومتربه ۵۹۵ نانومتر هنگام پیوند یافتن با پروتین است. با افزایش غلظت پروتین، جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر به سبب افزایش پیوندهای بین پروتین و رنگ Coomassie blue G-250، افزایش مییابد. برای تعیین همبستگی بین میزان جذب و غلظت پروتین، از غلظتهای استاندارد پروتین (بیشتر آلبومین سرم گاوی- BSA) استفاده میشود (Wenk and Fernandis, 2007).
در این آزمایش، اندازهگیری غلظت پروتین میتوکندریایی با روش Bradford و بر پایه رویه توضیح داده شده بهوسیله لارنس و داویس(Lawrence and Davies 1986) انجام شد. برای تهیه محلول Bradford، ۱۰ میلی گرم رنگ Coomassie blue G-250 در ۵ میلی لیتر اتانول ۹۵% بهطور کامل حل شد. سپس، ۱۰ میلی لیتر فسفریک اسید ۸۵% به آن افزوده شد و پس از رساندن حجم به ۱۰۰ میلی لیتر، در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد. آلبومین سرم گاوی بهعنوان محلول پروتین استاندارد، بهکار برده شد. در آغاز، محلولی دارای یک میلی‎گرم BSA دریک میلی لیتر محلول II تهیه شد و سپس، به غلظتهای ۲۵/۰، ۵/۰، ۷۵/۰، ۱ و ۵/۱ میلی‎گرم در میلی لیتر آماده شدند. از هر غلظت پروتین استاندارد،۱۰ میکرولیتر به ۹۹۰ میکرولیتر محلول Bradford (که پیشاپیش با دمای اتاق، همدما شده بود) افزوده شد، با پیپت کردن به‏طور کامل مخلوط شد و ۵ دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. در کیووت‎های پلاستیکی[۴۵] و اسپکتروفتومتر (TECHNE – Specgene، آمریکا)، مقدار جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر (۲ تکرار) اندازهگیری شد. مقدار جذب نور در حضور نمونههای دارای میتوکندری نیز با دوبار تکرار، اندازهگیری شد. اگر غلظت میتوکندریها بیشتر از بیشینه محلول استاندارد (۵/۱ میلیگرم/میلی لیتر) بود، با افزودن حجمی برابر با حجم نمونه از محلول II، غلظت به نصف کاهش داده شد. سپس، معادله خط همبستگی میزان جذب نور و غلظت پروتین محاسبه و غلظت نمونه ها تعیین شد (نگاره ۳-۳).
نگاره ۳-۳: همبستگی مقدار جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر با غلظت پروتین.

۳-۲-۳- اندازهگیری فعالیت مجموعههای آنزیمی زنجیرهی تنفسی

فعالیت هر یک از مجموعههای آنزیمی زنجیره تنفسی (Cox I-V) با روش بوهرسنوتت (Bouhours-Nouetet al., ۲۰۰۵) و سندلاین(Sandelin, 2005) ، با اسپکتروفتومتر UV (TECHNE – Specgene) و در کیووت کوارتز، تغییر در جذب نور به سبب تغییر در غلظت سوبسترای ویژه هر یک از آنزیمها اندازهگیری شد. برای شکستن غشای میتوکندری، محلول دارای میتوکندری سه بار در نیتروژن مایع، یخزده شد و سپس یخ گشایی شد. اندازهگیریها، در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و در حجم پایانی ۵۰۰ میکرولیتر و با دوبار تکرار برای هر نمونه، انجام شد. با استفاده از ضریب جذب، فعالیت هر یک از آنزیمها، کمی شده و بهصورت واحد در میلیگرم پروتین میتوکندریایی بیان شد.

۳-۲-۳-۱- اندازهگیری فعالیت مجموعه آنزیمی I (NADH – یوبیکویینون اکسیدو ردوکتاز)

در زنجیره تنفسی، Complex I یک مجموعه آنزیم بزرگ با ۴۲ زنجیره پلی پپتیدی و دارای یک فلاووپروتین و حداقل شش مرکز آهن-سولفور است. الکترون به وسیلهی بازوی ماتریکسی Cox I از NADH گرفته شده و در بازوی درون غشایی به یوبیکویینون[۴۶] داده می‎شود (نگاره ۳-۴). روتنون[۴۷] که یک ترکیب گیاهی است و بهطور رایج بهعنوان حشرهکش مورد استفاده قرار میگیرد، فعالیت Cox I را مهار میکند (Lehninger, 2004). بهسبب اینکه برخی آنزیم‏ها مانند NADH: cytochorome b5 reductase (یک آنزیم اکسید کننده NADH، چسبیده به غشای بیرونی میتوکندری و غیر حساس به روتنون)، فعالیت همانندی با Cox I دارند، ارزیابی فعالیت ویژهی Cox I، بهصورت فعالیت حساس به روتنون[۴۸] اندازهگیری میشود (Pon, 2001 Schon and).
نگاره ۳-۴: ساختار و کنش مجموعهآنزیمی I زنجیره تنفسی(Lehninger, 2004).
اندازهگیری در چند گامه انجام شد:
الف) تهیه محلولهای KH2PO4 (۱۰۰ میلیگرم در میلیلیتر آب، ۵/۷=pH)، KCN (یک میلیگرم در میلیلیتر آب)، MgCl2 (۱۰ میلیگرم در میلیلیتر آب)، Antimycin A (یک میلیگرم در میلیلیتر اتانول)، یوبیکویینون ۲ (یک میلیگرم در میلیلیتر اتانول)، BSA (دو میلیگرم در میلیلیتر آب) NADH (یک میلیگرم در میلیلیتر اتانول) و Rotenone (یک میلیگرم در میلیلیتر اتانول).
ب) انکوباسیون ۱۰ تا ۲۰ میکروگرم پروتین میتوکندریایی (۱۰ میکرولیتر از محلول میتوکندری جداسازی شده) در ۲۴۰ میکرولیتر آب در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد برای ۲ دقیقه درون کیووت کوارتز.
پ) افزودن محلول واکنشی شامل ۱۰ میلیمولار KH2PO4، ۲/۵ میلیمولار KCN، دو میکروگرم در میلیلیتر Antimycin A، ۱۰۰ میکرومولار یوبیکویینون ۲، یک میلی‎گرم در میلی‎لیتر BSA و ۲/۵ میلیمولار MgCl2، قرار دادن در دستگاه اسپکتروفتومتر و صفر کردن مقدار جذب نور در طول موج ۳۴۰ نانومتر.
ت) آغاز واکنش با افزودن ۲۰۰ میکرومولار NADH و مخلوط کردن کامل آن با محلول واکنشی بهوسیله پیپت کردن.
ث) خواندن مقدار جذب نور ۵ دقیقه پیش و پس از افزودن دو میکروگرم در میلی‎لیتر روتنون.
ج) محاسبه مقدار کاهش جذب نور ویژهی فعالیت Cox I، ضرب کردن آن در ضریب جذب mM-1cm-1 ۲۲/۶ برای محاسبه مقدار فعالیت آنزیم و تصحیح آن برای یک میلی‎گرم پروتین میتوکندریایی (معادله ۳-۱).
معادله ۳-۱
Cox I activity (U/mg Protein.)= {[(A-A’)]-[(A’-A” × (۶٫۲۲×۱۰۰۰)]}/(C×۱۰)
A= NADH مقدار جذب نور در زمان افزودن
A’= مقدار جذب نور پیش از افزودن روتنون
A”= مقدار جذب نور پنج دقیقه پس از افزودن روتنون
C= غلظت میتوکندری (میلیگرم پروتین در میلیلیتر)

۳-۲-۳-۲- اندازهگیری فعالیت مجموعه آنزیمی II (سوکسینات دیهیدروژناز[۴۹])

کمپلکس II که بهنامهای سوکسینات دیهیدروژناز و یا سوکسینات: یوبیکویینون اکسیدوردوکتاز[۵۰] نیز شناخته میشود، کوچکترین مجموعه آنزیمی زنجیره تنفسی (انتقال الکترون از FADH به یوبیکویینون) و همچنین تنها آنزیم پیوند شده با غشا در چرخه کربس (تبدیل سوکسینات به فومارت) بهشمار میآید. این آنزیم دارای چهار زیر واحد پروتینی و سه هسته آهن- سولفور است (Lehninger, 2004) (نگاره ۳-۵). فعالیت این آنزیم به دو صورت فعالیت سوکسینات دیهیدروژنازی و یا سوکسینات: ابی کویی نون اکسیدوردوکتازی اندازه‎گیری می‏شود. در روش نخست، تغییر جذب نور در طول موج ۶۰۰ نانومتر درپی احیا شدن ۲و۶ دی کلروفنول ایندوفنول[۵۱] (DCPIP) با فنازین متوسولفات (PMS) شاخصی برای میزان فعالیت آنزیم است و در روش دوم، تغییرات جذب در همین طول موج درپی احیای ۲و۶ دی کلروفنول ایندوفنول با یوبیکویینون ۲ اندازه گیری میشود. هر دو روش، برای اندازهگیری میزان فعالیت Complxe II مناسب است. شایان توجه است که، به سبب اثر مهارکنندگی اگزالواستات، بخشی از Complxe IIها نافعال میشوند و برای اندازهگیری فعالیت این آنزیم به‎طور کامل، باید برای مدت کوتاهی با سوکسینات انکوباتور شود (Pon, 2001 Schon and).
نگاره ۳-۵: ساختار Complxe II زنجیره تنفسی میتوکندری (Scheffler, 2008).
در این آزمایش، فعالیت سوکسینات دیهیدروژنازی Cox II اندازهگیری شد. پس از تهیه محلولهای آبی KH2PO4 (۱۰۰ میلیگرم در میلیلیتر، ۵/۷=pH)، Sodium succinate (100 میلیگرم در میلیلیتر)، KCN (یک میلیگرم در میلیلیتر)، PMS (یک میلیگرم در میلیلیتر) و DCPIP (یک میلیگرم در میلیلیتر)، آزمایش به ترتیب زیر انجام شد:
الف) مقدار ۱۰ تا ۲۰ میکروگرم پروتین میتوکندریایی (۱۰ میکرولیتر از محلول میتوکندری جداسازی شده) برای سه دقیقه درون محلول واکنشی شامل ۵۰ میلی مولار KH2PO4، ۱۶ میلی مولار Sodium succinate، ۵/۱ میلی مولار KCN و ۱۰۰ میکرومولار PMS در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد در انکوباتور نگهداری شد.
ب) دستگاه اسپکتروفتومتر برای طول موج ۶۰۰ نانومتر تنظیم و با محلول واکنشی دارای میتوکندری بلانک شد.
پ) مقدار ۱۰۰ میکرولیتر DCPIP بهمحلول افزوده شد و پس از مخلوط کردن کامل آن بهوسیله پیپت کردن، مقدار جذب نور خوانده شده و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد نگهداری شد.
ت) پس از پنج دقیقه، دوباره جذب نور اندازه گیری و مقدار کاهش نور محاسبه شد.
ث) با استفاده از ضریب جذب mM-1cm-1 ۲۱ (Sandelin, 2005) و تصحیح برای یک میلیگرم پروتین، مقدار فعالیت Cox II گزارش شد.