تحقیق دانشگاهی – بررسی مقاومت افزایش یافته به آنتی بیوتیک‌های گروه آمینوگلیکوزیدی (HLAR) در انتروکوکوس فکالیس …

extension

۵

۷۲

Final extension

۳-۱۲-۶-روش اجرا Multiplex PCR

نمونه های DNA تخلیص یافته بیماران و نیز مواد مورد نیاز را از فریزر و یخچال خارج نموده و اجازه دادیم ذوب شده و به دمای اتاق برسند. به تعداد نمونه ها و نیز کنترل مثبت و کنترل منفی، میکروتیوب های مخصوص PCR به ترتیب شماره گذاری شده و در جا لوله ای قرار داده شدند. با هر سری آزمایش PCR، باید یک کنترل مثبت و یک کنترل منفی مورد استفاده قرار گیرد.

۳-۱۲-۷-آشکارسازی محصولات PCR

تهیه بافر TBE
ابتدا باید بافر مخصوص الکتروفورز تهیه شود که به این منظور ۲۵۰ میلیلیتر بافر TBE، ۲۵ گرم تریس باز بعلاوۀ ۷۵/۱۳ گرم بوریک اسید و ۱۰ میلیلیتر EDTAی ۵/۰ میلیمولار با ۸ pH ~ مخلوط میگردد و سپس حجم آن با آب مقطر دو بار تقطیر به ۲۵۰ میلیلیتر میرسد. محلول حاضر ۱۰X بوده و برای مصرف باید به نسبت ۱ به ۹ رقیق شود.
بطور معمول از رنگی فلورسنتی به نام اتیدیوم بروماید استفاده میشود. این ماده دارای عامل درج شونده بین بازهای DNA میباشد. وقتی در معرض امواج ماورای بنفش قرار میگیرد، اثر فلورسنتی خود را بروز داده و هر چه میزان DNA بیشتر باشد، اثر فلورسنتی و میزان طیف رنگی بیشتر خواهد بود.

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت  jemo.ir  مراجعه نمایید.

۳-۱۲-۸-روش انجام الکتروفورز:

درصد آگارز بکار رفته بسته به اندازۀ DNA و عملی که قرار است انجام شود، متفاوت است. در این تحقیق از ژل آگارز ۸/۰% برای مشاهده محصولات PCR در Gel Dock و از ژل ۱% برای Clean up و تخلیص آنها استفاده شد.

۳-۱۲-۹-روش تهیۀ ژل آگارز به ترتیب زیر است:

۱- قالب ژل (کاست) با طول و عرض مناسب بسته به تعداد نمونهها انتخاب و با چسب مسدود و آماده میشود.
۲- برای ایجاد چاهکها شانههایی با دندانههای مناسب انتخاب و داخل قالب قرار میگیرد، به طوری که دندانههای شانه اندکی با سطح قالب فاصله داشته باشد.
۳-حجم ژل مورد استفاده با توجه به اندازۀ قالب و قطر ژل مورد نظر تهیه میشود. به طوری که؛ پودر آگارز پس از توزین، در مقدار مناسبی ۱X)) TBE حل شده و سه دقیقه جوشانده میشود .
۴- پس از اینکه دمای محلول آگارز به حدود ۵۵ درجه رسید، به ازای هر ۱۰ میلیلیتر ژل یک میکرولیتر میکروگرم /ml)1-5/0) اتیدیوم بروماید اضافه و پس از مخلوط شدن در داخل قالب ریخته میشود.
۵- پس از اینکه ژل بطور کامل بسته شد، شانه را خارج و ژل در داخل تانک الکتروفورز قرار میگیرد.
۶- برای هر چاهک ۲ میکرولیتر رنگ بارگذاری با ۴-۳ میکرولیتر از نمونۀ DNA در روی چسب شیشهای تمیز پیپتاژ و کاملاً مخلوط میشود و سپس به آرامی داخل چاهکها قرار میگیرند .
۷- بافرتانک (TBE-1X) باید کاملاً روی ژل را بگیرد. تانک الکتروفورز به منبع تغذیه متصل شده و ولتاژ آن در حدود ۸۰-۷۰ ولت تنظیم میشود.
۸- وقتی رنگ نشانه، سه چهارم طول ژل را طی کرد، ژل از تانک خارج و در دستگاه Gel-Documentation با نورUV نتیجه مشاهده و عکسبرداری میگردد.

۳-۱۲-۱۰-خالص سازی محصولات PCR

هریک از محصولات PCR باید تخلیص شوند تا برای مراحل بعدی آماده شوند، بنابراین قطعات تولید شده با استفاده از کیتهای Fermentas وBioneer تخلیص شدند که این پروسه اصطلاحاً Clean up نام دارد. به این منظور ژل ۱% (۱ گرم آگارز درcc 100 بافر TBE ) تهیه میشود، و کل محصول PCR در چاهک ها بارگذاری میشوند و بعد از مشاهده در Gel dock، در روی دستگاه ترانسیلومینیتور[۶۳] قطعاتDNA از روی ژل بریده و در تیوبهای ۵/۱ میلیلیتری قرار میگیرند. سپس طی پروسههای ذیل با استفاده از کیتهای ذکر شده و پروتوکل مربوطه، تخلیص میگردند:
-با کیت Fermentas
۱- به هر تیوب ۵۰۰ میکرولیتر بافر اتصال(Binding Buffer ) افزوده میشود.
۲- به هر یک ۵۰ میکرولیتر بافر تبدیل (Converted Buffer) افزوده و مخلوط میشوند.
۳- تیوبها ۳ تا ۵ دقیقه در دمای ۵۵ درجۀ بن ماری قرار میگیرند، تا ژل به طور کامل آب شود.
۴- به هر تیوب ۱۰ میکرولیتر سیلیکا افزوده میگردد.
۵- مخلوط ۵ دقیقه در ۵۵ درجه قرار گرفته و هر ۲ دقیقه یکبار مخلوط میشود تا سیلیکا ته نشین نشود.
۶- تیوبها یک دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ میگردند.
۷- مایع رویی خالی و سپس به هر یک ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو(Washing Buffer) افزوده میشود.
۸- تیوبها یک دقیقه در۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ میگردند.
۹- مایع رویی خالی و دوباره به هر یک ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو افزوده میشود.
۱۰- تیوبها یک دقیقه در۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ میگردند.