بررسی مقاومت افزایش یافته به آنتی بیوتیک‌های گروه آمینوگلیکوزیدی (HLAR) در انتروکوکوس فکالیس با روش کشت …

Gel loading buffer

۰/۲۵ % Bromo phenol blue
۰/۲۵ % Xylen cyanol
۴۰ % Sucrose

از این بافر برای ریختن نمونه حاوی قطعات DNA به درون چاهکهای ژل آگارز و انجام الکتروفورز استفاده می‌شود. این بافر دارای دو رنگ بروموفنل بلو و زایلن سیانول است که به ترتیب جلوتر و عقبتر از نمونه DNA حرکت کرده و از این طریق جایگاه نمونه را در درون ژل مشخص می‌کنند. همچنین این بافر دارای یک ماده با ویسکوزیته بالا و سنگین (نظیر گلیسرول، فایکول و یا محلول غلیظ سوکروز) نیز می‌باشد که این ماده سبب قرارگرفتن نمونه در ته چاهک و عدم پخش آن در درون بافر تانک می‌شود. این بافر معمولاً با غلظت x6 تهیه میگردد که هنگام استفاده به نسبت۱ به ۵ با محصول PCR مخلوط و درون چاهک ریخته می‌شود.

برای دانلود فایل متن کامل پایان نامه به سایت ۴۰y.ir مراجعه نمایید.

۳-۵-آزمایش‌های بیوشیمیایی

۳-۶-ﺗﺴﺖ ﮐﺎﺗﺎﻻز

برای این مطالعه با استفاده از سواب استریل، مقدار کمی از کشت خالص ارگانیسم رادر سرم فیزیولوژی حل نموده. سپس یک قطره از پراکسید هیدروژن ۳% (H2O2) به آن اضافه میکنیم . سپس از نظر آزاد شدن حباب‌های گاز اکسیژن لازم را مورد بررسی قرار می‌دهیم. آزاد شدن حباب‌های گاز نشان دهنده وجود آنزیم کاتالاز در میکروارگانیسم است که موجب شکسته شدن پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن می‌گردد.

۳-۷-ﺗﻤﺎﯾﺰ انتروکوکها از ﺳﺎﯾﺮ استرپتوکوکها

ﺑﺎﮐﺘﺮی ﻣﺸﮑﻮک ﺑﻪ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس فکالیس روی ﻣﺤﯿﻂ آﮔﺎرﺧﻮﻧﺪار ۵% ﮐﺸﺖ داده ﻣﯽ ﺷﺪند و دﯾﺴﮑﻬﺎی ﺑﺎﺳﯿﺘﺮاﺳﻦ و ﺗﺮی ﻣﺘﻮﭘﺮﯾﻢ ﺳﻮﻟﻔﺎﻣﺘﻮﮐﺴﺎزول () sxtروی ﻣﺤﯿﻂ ﮐﺸﺖ ﻗﺮار داده ﻣﯽ ﺷﺪ. ﭘﺲ از ۲۴ ﺳﺎﻋﺖ اﻧﮑﻮﺑﺎﺳﯿﻮن در C0 ۳۷، از ﻃﺮﯾﻖ ﻋﺪم رﺷﺪ ﺑﺎﮐﺘﺮی در ﻣﺠﺎورت اﯾﻦ دﯾﺴﮏﻫﺎ، ﺑﻪ اﻧﺘﺮوﮐﻮک ﺑﻮدن آﻧﻬﺎ ﻣﺸﮑﻮک ﻣﯽ ﺷﺪﯾﻢ (۱، ۱۷۰).

۳-۷-۱- ﮐﺸﺖ ﺑﺮ روی ﺑﺎﯾﻞ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ آﮔﺎر

ﮐﻠﻨﯽﻫﺎی ﻣﺸﮑﻮک ﺑﻪ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس فکالیس روی ﻣﺤﯿﻂ ﺑﺎﯾﻞ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ آﮔﺎرﮐﺸﺖ داده می شوند و ﺑﻌﺪ از ۲۴ ﺳﺎﻋﺖ اﻧﮑﻮﺑﺎﺳﯿﻮن در ۳۷ درﺟﻪ سلسیوس، ﺗﻐﯿﯿﺮ رﻧﮓ ﻣﺤﯿﻂ از زرد ﺑﻪ ﻗﻬﻮه ای ﺗﯿﺮه ﺗﺎ ﺳﯿﺎه ﻧﺸﺎن دﻫﻨﺪه ﻫﯿﺪروﻟﯿﺰ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ ﺑﻮد. در اﯾﻦ واﮐﻨﺶ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ ﺑﻪ ۶ و ۷ دی ﻫﯿﺪروﮐﺴﯽ ﮐﻮﻣﺎرﯾﻦ ﺗﺒﺪﯾﻞ ﺷﺪه و اﯾﻦ ﻣﺎده ﺣﺪ واﺳﻂ، در ﺣﻀﻮر آﻫﻦ رﻧﮓ ﻣﺤﯿﻂ را ﺑﻪ رﻧﮓ ﻗﻬﻮه ای ﺗﺒﺪﯾﻞ ﻣﯽ ﮐﻨﺪ. انتروکوکهای و استرپتوکوکهای گروه D ﻫﺮ دو ﻗﺎدر ﺑﻪ ﺗﺠﺰﯾﻪ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ می‌باشند وﻟﯽ ﺟﻬﺖ ﺟﺪا ﻧﻤﻮدن آن دو از ﯾﮑﺪﯾﮕﺮ از رﺷﺪ در محیط %۶٫۵ نمک اﺳﺘﻔﺎده میﮐﻨﻨﺪ. (۱, ۱۷۰).

ﺗﺴﺖ ﺗﺨﻤﯿﺮ ﻗﻨﺪآراﺑﯿﻨﻮز

از تست تخمیر قند آرابینوز برای جداسازی دو سویه استفاده میشود. به این صورت که ﻣﺤﯿﻂ ﭘﺎﯾﻪ ﺣﺎوی دو درصد آراﺑﯿﻨﻮز ﭘﺲ از ﺗﻠﻘﯿﺢ انتروکوک، ﺑﻪ ﻣﺪت ۲۴ ساعت در ۳۷ درجه سلسیوس گرمخانه گزاری ﺷﺪﻧﺪ. ﺗﻐﯿﯿﺮ رﻧﮓ ﻣﺤﯿﻂ از صورتی ﺑﻪ زرد ﻧﺸﺎن دهنده ﻣﺼﺮف ﻗﻨﺪ و ﺗﻮﻟﯿﺪ اﺳﯿﺪ میباشد. اﮔﺮ ﻗﻨﺪ ﻣﺼﺮف ﻧﺸﻮد رﻧﮓ ﻣﺤﯿﻂ، صورتیﺑﺎﻗﯽ ﻣﯽﻣﺎﻧﺪ. ﮐﻨﺘﺮل ﻣﺜﺒﺖ در اﯾﻦ ازﻣﺎﯾﺶ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﺎﺳﯿﻮم ۹۵۵۱۵ ATCC و ﮐﻨﺘﺮل ﻣﻨﻔﯽ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ ATCC21292بود.

۳-۸ رﺷﺪ در ۱۰ و ۴۵ درﺟﻪ سلسیوس

ﺑﺎﮐﺘﺮی ﻣﻮرد ﻧﻈﺮ در در TSB ﮐﺸﺖ داده ﺷﺪه و در ۴۵ درﺟﻪ ﺳﺎﻧﺘﯽ ﮔﺮاد گرم خانه گذاری می شدندوبرای بررسی رشد در C0 ۱۰ ازیخچال استفاده میشود. ﺑﺮای اﻧﺠﺎم اﯾﻦ ﺗﺴﺖ ﺑﺎﯾﺪ از ﮐﻠﻨﯽﻫﺎﯾﯽ ﮐﻪ ۲۴ -۱۸ ﺳﺎﻋﺖ ﮐﺸﺖ آﻧﻬﺎ ﮔﺬﺷﺘﻪ اﺳﺘﻔﺎده ﮐﺮد. زﻣﺎن ﺗﻠﻘﯿﺢ ﺗﺎ اﻧﮑﻮﺑﺎﺳﯿﻮن در ۱۰ ﯾﺎ ۴۵ درﺟﻪ ﻧﺒﺎﯾﺪ ﺑﯿﺶ از ۱۰ دﻗﯿﻘﻪ ﺑﺎﺷﺪ. اﻧﺘﺮوکوکوس فکالیس در ۱۰ و ۴۵ درﺟﻪ رﺷﺪ ﻣﯽﮐﻨﻨﺪ وﻟﯽ ﻟﮑﻮﻧﺴﺘﻮک در ۱۰ درﺟﻪ ﺳﺎﻧﺘﯿﮕﺮاد ﻗﺎدر ﺑﻪ رﺷﺪ ﻧﻤﯽ ﺑﺎﺷﻨﺪ. ﺑﺮای ﺗﺎﯾﯿﺪ روﺷﻬﺎی ﺗﺸﺨﯿﺺ از اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ ۲۱۲۹۲ ATCC ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﺳﻮﯾﻪ اﺳﺘﺎﻧﺪارد اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ (۱, ۱۷۰).

۳-۹-ﺗﻌﯿﯿﻦ اﻟﮕﻮی ﺣﺴﺎﺳﯿﺖ آﻧﺘﯽ ﺑﯿﻮﺗﯿﮑﯽ انتروکوکوس فکالیس

۳-۹-۱- استاندارد نیم مک فارلند سولفات باریم:

نیم میلی لیتر از کلرور باریم (BaCl2) mol/l 48.0.175 (2H2O .W/V BaCl2. 1%) را به ۵ml.99 اسید سولفوریکmol/ (V/V) 1 18.0%) اضافه کنید و با هم زدن مداوم سوسپانسیون بدست آورید.
چگالی صحیح کدورت استاندارد با استفاده از اندازه گیری جذب در اسپکتروفتومتر با طول مسیر نوری cm1، مشخص شود. جذب در nm 625 باید بین ۸/۰ تا ۱۳/۰ باشد.
سوسپانسیون سولفات باریم باید به مقدار ml 6-4 در لوله های در پیچ دار هم اندازه با لولههای سوسپانسیون باکتریایی ریخته شود.
درب این لوله ها باید محکم بسته شوند و در دمای اتاق و در تاریکی نگهداری گردند.
استاندارد سولفات باریم قبل از هر بار استفاده باید به شدت (ترجیحا با ورتکس مکانیکی) همزده شود، تا کدورت یکنواختی ایجادگردد. در صورت مشاهده ذرات بزرگ، باید استاندارد تازهای تهیه گردد.
استاندارد سولفات باریم باید به صورت ماهانه جایگزین شود یا جذب آن اندازه گیری گردد.

۳-۹-۳ آﻣﺎده ﮐﺮدن ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﯿﻮن ﺑﺎﮐﺘﺮی:

چند کلنی از ﺑﺎﮐﺘﺮی ﻣﻮرد ﻧﻈﺮ در سرم فیزیولوژی تلقیح می شود وکدورت آن رابامعادل۰٫۵ مک ﻓﺎرﻟند Cfu/m 5/1× ۱۰۸ ﺑﺮرﺳﯽ میگردد (۱۷۱).