بررسی مقاومت افزایش یافته به آنتی بیوتیک‌های گروه آمینوگلیکوزیدی (HLAR) در انتروکوکوس فکالیس …

Touchdown PCR
Degenearte PCR
Heminested PCR
RT–PCR
ARMS-PCR
Nested-PCR
Hot-Start PCR
Alu-PCR
PCR-ELISA
Real –Time PCR
Multiplex PCR
درادامه تنها به روش مولتی پلکس PCRکه در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفته است اشاره کوتاه میگردد:

Multiplex PCR

مولتی پلکس PCRیک نوع تغییر یافته از PCR می‌باشد که در آن دو یا بیش از دو لوکوس از ژن به طور همزمان در یک واکنش تکثیر میشود. از ۱۹۸۸ که برای اولین بار این روش توصیف شد بطور موفقیت‌آمیزی در خیلی از تست ها شامل آنالیز جهش ناشی از حذف، سایر جهشها، پلی مورفیسم یا سنجش کمی بکار رفته است. امروزه از این روش در شناسایی پاتوژنها، اسکرین جنسیت، آنالیز Linkage، مطالعات جرم شناسی، بررسی کیفیت و کمیت نمونه ها و تشخیص بیماریهای ژنتیکی استفاده میگردد. بطورکلی در شناسائی پاتوژنها، مولتی پلکس PCR باکتریها نشان دهنده یک پاتوژن خاص در میان دیگر باکتریها یا تمایز گونه ها یا سویهها در یک جنس می‌باشد. در مولتی پلکس PCR صرف زمان و معرف نسبت به PCR معمولی که در چندین لوله انجام میشود کمتر می‌باشد به همین دلیل واکنش مولتی پلکس برای استفاده کم از آنزیم و الگوها بسیارمناسب است (۹۶).

دانلود متن کامل پایان نامه در سایت jemo.ir موجود است

طراحی و اجرای Multiplex PCR

در مولتی پلکس PCR میتوان دو مجموعه از پرایمرها که شرایط واکنش آنها بطور جداگانه ارزیابی شده است را با هم مخلوط کرد. هرچند در بعضی مولتی پلکس PCR با توجه به ملاحظات دقیق برای نواحی که آمپلی می‌شوند، اندازه نسبی قطعات، دینامیک پرایمرها و بهینه کردن تکنیک PCR با چندین قطعه مناسب تغییراتی داده شده است. مانند تمام انواع PCR باید در مولتی پلکس PCR اهداف را مشخص کرد و با توجه به آنها پرایمرها را طراحی نمود. این پرایمرها بایستی دارای کنتیک واکنش مشابهای باشند، مقدار C/G پرایمرها حدود ۶۰-۴۰%، طول آنها ۲۸-۲۳ نوکلئوتید و درجه حرارت annealing متوسط داشته باشند. درجه حرارت annealing اولیه و غلظت مواد باید ابتدا ارزیابی شوند، هرچندکه این شرایط را می توان در مولتی پلکس PCR بصورت تجربی بدست آورد. به همین دلیل شرایط برای هر مجموعه پرایمر می بایستی بطور جداگانه طراحی شود و اگر در مجموعه های پرایمر نیاز به اصلاح بود تغییرات اعمال گردد (۱۵۲-۱۵۴)
جفتهای پرایمر در هنگامی که جدا کار می‌کنند مشکلی ندارند، ولی وقتی به صورت ترکیبی بکار می روند مشکل بوجود میآید که برای رفع مشکلات می توان از اتانول مناسب در استات سدیم۳/۰ مولار استفاده کرد. احتمال تشکیل جفت های غیراختصاصی و آرتیفکت ها در اضافه کردن هر مجموعه پرایمر افزایش پیدا میکند. برای رفع باندهای نامناسب مولتی پلکس PCR می توان ازhot-start PCR، اضافه کردن مواد آلی، بالا بردن درجه حرارت annealing استفاده کرد و همچنین اگر از موارد فوق استفاده شد و باندهای نامناسب هنوز وجود داشت بایستی پرایمر جدید طراحی شوند (۱۵۵, ۱۵۶).
اگر در غلظت های مولار محصول بدست نیامد و برای همه قطعات آمپلی فیکاسیون صورت نگرفت، بایستی غلظت بعضی از جفت پرایمرها را کاهش داد. این تغییر به خصوص در نمونه هائی که یک هدف بیش از دیگر اهداف دارند مفید می‌باشد. ارتباط معکوسی بین غلظت الیگونوکلئوتید مورد نیاز در مولتی پلکس PCRو مقدار ATP آنها وجود دارد، اما ارتباطی بین موارد فوق با طول الیگونوکلئوتید و Tm وجود ندارد.
هنگامی که بین همه جفت پرایمرها سازگاری وجود ندارد، بایستی آنها را در چندین واکنش مولتی پلکس PCRکوچکتر بررسی کرد. مثلاً در یک پژوهش در ابتدا ۱۸ جفت پرایمر و سپس با اپتیمایز کردن شرایط واکنش با ۲۶ جفت پرایمر برای شناسائی ژن دیستروفی در مولتی پلکس PCR استفاده گردیده است(۱۵۵, ۱۵۶).

تیتراسیون اجزای واکنش:

در PCR به خصوص در مولتی پلکس PCR ضروری است که غلظتهای مختلف اجزای واکنش برای بدست آوردن بالاترین کارآئی روش PCR با همدیگر متناسب شوند. غلظت Mg2+ و dNTP و آنزیم پلی مراز اغلب روی تعداد آمپلی کون در مالتی پلکس اثر میگذارند، لذا مانند روش PCR معمولی، غلظت ها بایستی بهینهسازی شوند، چراکه جفت پرایمرها ممکن است دارای نیازمندیهای متفاوت باشند. سیستم های بافری بطور خیره کننده در آمپلی فیکاسیون موثر هستند. از DMSO میتوان به عنوان بازدارنده یا اجزای مفید در مولتی پلکس PCRاستفاده کرد. مواد افزودنی که سبب کاهش باندهای غیر اختصاصی در مولتی پلکس PCR می شود عبارتنداز: توئین۲۰، تریتون ۱۰۰-X،ß مرکاپتواتانول و کلرید تترامتیل آمونیم (۱۵۵, ۱۵۶).

شرایط ترموسایکلر:

پارامترهای ترموسایکلر با سکانس مجموعههای پرایمر تعیین میشود. عموماً هرچه تعداد اهداف بیشتر باشد زمان بیشتری باید برای انجام PCRدر نظر گرفته شود. هرچند که در اینجا بایستی این نکته را در نظر داشت که هرچه زمانannealing و extension طولانیتر شود فرصت برای آمپلی فیکاسیون غیراختصاصی هم افزایش مییابد (۱۵۵, ۱۵۶).

تعریف واژهها

عفونت ادراری: حضور بیش از ۱۰۶ باکتری در هر میلی لیتر ادرار
مقاومت آنتی بیوتیکی (حساسیت دارویی): (MIC) حداقل غلظت لازم برای رشد باکتری
PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز با دستگاه Thermo cycler انجام میشود که شامل مراحل زیر است:
Denaturation: باید دو رشته مورد نظر از هم جدا شوند که به مدت ۳ دقیقه در دمای ۹۴ تا ۹۵ درجه سلسیوس صورت میگیرد.
Annealing: جفت شدن ژنها با پرایمر مورد نظر است که به مدت ۳ دقیقه در دمای ۵۵ تا ۶۰ درجه سلسیوس انجام میشود پرایمرها از قبل توسط نرم افزار طراحی پرایمر و بر اساس ژنهای مورد نظر طراحی میشود
Extension: پلیمریزاسیون با کمک DNA پلیمراز به مدت ۳ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سلسیوس است.
Final extension: در دمای ۷۲ درجه سلسیوس به مدت ۱۰ دقیقه انجام میشود
فصل دوم
( مبانی و تاریخچه)

مروری بر منابع

در گروه میکروب شناسی علوم پزشکی ایلام دکتر محمدی به همراه دیگر همکاران در تابستان سال ۱۳۹۰ به بررسی فراوانی مقاومت دارویی گونههای انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم برروی سویه‌های مقاوم به آنتی بیوتیک ونکومایسین با روش PCR پرداختند (۱۵۷). در طی این مطالعه انتروکوکهای مقاومی به تعداد زیادی از آنتی بیوتیکها یافت شد. که خود عاملی در شکل گیری عدم درمان مناسب با آنتی بیوتیکها بود. در این بررسی مشخص شد حضور ژنهای VanAوVanB در انتروکوکها در ارتباط با مقاومت به غلظت بالای ونکومایسین می‌باشد.که در بین ۱۲ سویه از انتروکوکها ژنA Vanدیده شد در حالیکه ژن VanB در هیچکدام از سویه ها مشاهده نشد.و مشخص گردید که ژن VanA مهم ترین عامل در شکل گیری مقاومت به ونکومایسین نسبت به ژن VanBمیباشد (۱۵۷).
در سال ۱۳۸۶ گروهی ازمحققین به سرپرستی دکتر فاتح رحیمی دکتر مهناز سیفی انیستیتو پاستور ایران به بررسی کلونالیتی سویه های انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فیسیوم مقاوم به مقادیر بالای جنتامایسین جدا شده از فاضلابهای شهر تهران جمع آوری شده بود. در این بررسی مشخص شد که سویه‌های انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم چند مقاومتی دارای ژنهای aac(6)Ie_aph(2)Ia هستند که این ژن ها به مقادیر بالای جنتامایسین مقاوم میباشند. در نتیجه مشخص شد که این دو ژن از ژنهای مهم در ایجاد مقاومت انتروکوکی به جنتامایسین میباشند (۱۷۸).
در سال ۱۳۸۷ دکتر قاسمی و همکارانش در گروه میکروب شناسی در دانشکده علوم پزشکی کاشان به بررسی مقاومت چند دارویی در سویه‌های انتروکوکوس فکالیس جدا شده از نمونههای بالینی در بیمارستان شهید بهشتی و زایشگاه شبیه خوانی کاشان پرداختند. که این مطالعه به طور توصیفی بر روی ۱۰۶ سویه انتروکوکوس فکالیس انجام پذیرفت (۱۷۹). تست تعیین مقاومت آنتی بیوتیکی را با روش دیسک دیفوژن و طبق دستورالعملclinic and laboratory standards institute انجام دادند که حداقل غلظت مهاری به ونکومایسین با روش AB E.test biodisk soluaانجام گرفت. پس از آزمایشهای صورت گرفته مشخص شد که مقاومت انتروکوکوس فکالیس به اریترومایسین در ۵۶ سویه(۵۲٫۸ )و سیپروفلوکساسین در ۴۳ سویه(۴۰٫۶) و به جنتامایسین در ۴۱ سویه (۳۲) پنی سیلین در ۳۱سویه (۲۹٫۲) و به نیتروفورانتویین۲۰ سویه (۱۸٫۸) ایمی پنم در ۱۱ سویه (۱۰٫۴) و به ونکومایسین در ۶ سویه (۴٫۷) میباشد. پس به طور کلی ظهور مقاومت به چند آنتی بیوتیک و میزان مقاومت بالا به ونکومایسین در سویه‌های انتروکوکوس فکالیس شایان توجه بود که مشخص شدبا انجام درمان مناسب عفونت های ایجاد شده توسط انتروکوکها کاهش پیدا کرده است (۱۵۹).
دکتر فیض آبادی و گروهی از همکاران ایشان در طی سالهای ۱۳۸۲-۱۳۷۹ در بیمارستانهای لبافی نژاد و شهید چمران به بررسی الگوی مقاومت دارویی سویه انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم پرداختند (۱۵۹). در این تحقیق تعداد ۳۳۹ سویه انتروکوک از بیماران بستری و سر پایی جدا شد و مورد بررسی قرار گرفت و کلیه سویهها با استفاده از آزمایش‌ها باکتریولوژی و PCR شناسایی‌شده و الگوی مقاومت دارویی آنها با استفاده از روش کربی بائر نسبت به آنتی بیوتیک های پنیسیلین، آمپیسیلین، ونکومایسین و لینزولید تعیین گردید.آنچه در این مطالعه وپژوهش به دست آمد به شرح زیر می‌باشد:
از ۳۳۹ سویه انتروکوکی،۲۷۳سویه (۷۷٫۵) به گونه فکالیس و ۶۶ سویه (۲۲٫۵) به گونه فاسیوم تعلق داشت. سویه‌های انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم به ترتیب نسبت به آنتی بیوتیکهای آمپیسیلین (۱۳دربرابر۷۷) پنیسیلین (۱۴ دربرابر ۹۵) سیپروفلوکساسین (۵۷ دربرابر ۸۰) نیتروفورانتوئین در برابر ۵۴) ایمیپنم (۳ در برابر ۸۳) وکلرآمفینیکل( ۵ در برابر۲۰) مقاوم بودند. در نتیجه با دست یافتن به این داده ها مشخص گردید که با افزایش فراوانی سویه‌های (HLGR) اثر سینرژی جنتامایسین با گلیکوپپتیدها و بتالاکتامها مهار گردیده وهمین امر منجر به عدم درمان مناسب در بیماران میگردد، همچنین مشخص شد که داروی لینزولید و کینوپریستین/دالفوپریستین توان مقابله با سویه‌های انتروکوکوس فاسیوم مقاوم به چند دارو از جمله سویه‌های مقاوم به گلیکوپپتیدها را در ایران داشته در حالی که مصرف تیکوپلانین در کشور با توجه به حضورژنهای کلاسترvanA قابل تامل می‌باشد.