دسته بندی علمی – پژوهشی : بررسی مقاومت افزایش یافته به آنتی بیوتیک‌های گروه آمینوگلیکوزیدی (HLAR) در انتروکوکوس فکالیس با روش کشت …

ﺗﻮاﻟﯽ ژن ﻣﺮﺑﻮط ﺑﻪ ۵۰۱) catPIPژن ﻣﻘﺎوﻣﺖ در ﺑﺮاﺑﺮ ﮐﻠﺮاﻣﻔﻨﯿﮑﻞ ﻣﻮﺟﻮد ﺑﺮ روی ﭘﻼﺳﻤﯿﺪ ۵۰۱(PIP در اﯾﺰوﻟﻪ ﻫﺎی اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ و اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﺎﺳﯿﻮم ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﺷﺪه اﺳﺖ. ژﻧﻬﺎی catscs7 استافیلوکوکوس (ژن ﻣﻘﺎوﻣﺖ در ﺑﺮاﺑﺮ ﮐﻠﺮاﻣﻔﻨﯿﮑﻞ ﻣﻮﺟﻮد ﺑﺮ روی ﭘﻼﺳﻤﯿﺪ) ژن pscs7 و carpc194 (ژن مقاومت در برابر کلرامفنیکل موجود بر روی پلاسمید pc194) در انتروکوکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ و اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﺎﺳﯿﻮم ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﺷﺪه اﺳﺖ. ژﻧﻬﺎی ﮐﻠﺮاﻣﻔﻨﯿﮑﻞ اﺳﺘﯿﻞ ﺗﺮاﻧﺴﻔﺮاز ()cat ﻣﻌﻤﻮﻻ ﻣﻨﺸﺎء ﭘﻼﺳﻤﯿﺪ ی دارﻧﺪ وﻟﯽ ﻣﻤﮑﻦ اﺳﺖ ﺑﺮ روی ﮐﺮوﻣﻮزوم ﻧﯿﺰ ﻗﺮار داﺷﺘﻪ ﺑﺎﺷﻨﺪ (۱۲۷). وجود ژن های cat ﻣﺸﺎﺑﻪ در اﻧﺘﺮوﮐﻮک، اﺳﺘﺮﭘﺘﻮﮐﻮک و اﺳﺘﺎﻓﯿﻠﻮﮐﻮک ﻧﺸﺎن دﻫﻨﺪه اﻧﺘﻘﺎل اﻓﻘﯽ ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﮐﻠﺮاﻣﻔﻨﯿﮑﻞ ﺑﯿﻦ اﯾﻦ ﮔﻮﻧﻪﻫﺎ می‌باشد. وﺟﻮد ﭘﻤﭗ ﻓﻌﺎل ﮐﻠﺮاﻣﻔﻨﯿﮑﻞ ﻫﻤﺮاه ﺑﺎ ﻧﻮرﻓﻠﻮﮐﺴﺎﺳﯿﻦ در ﭼﻬﺎر ﺳﻮﯾﻪ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ و ﯾﮏ ﺳﻮﯾﻪ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﺎﺳﯿﻮم ﻧﺸﺎن داده ﺷﺪه اﺳﺖ. ﻣﮑﺎﻧﯿﺴﻢ ﻋﻤﻞ اﯾﻦ ﭘﻤﭗ ﻫﻨﻮز ﻣﺸﺨﺺ نمی‌باشد (۱۲۸).

مقاومت به آمینوگلیکوزید ها[۵۵]

آمینوگلیکوزیدها، عوامل ضدباکتریایی قوی و با طیف وسیع باکتریسیدالی هستند که اهمیت ویژه ای در درمان عفونت های حاد دارا میباشند (۹۰). این خانواده آنتی بیوتیکی، نخستین بار در سال ۱۹۴۴ به صورت کلینیکی و در غالب آنتی بیوتیک استرپتومایسین مورد استفاده قرار گرفت (۹۰, ۱۲۹). گرچه آنتی بیوتیکهای این خانواده دارای پارهای از عوارض همچون سمیت دستگاه شنوایی (ototoxiciy) و سمیت کلیوی (nephrotoxicity) می باشند (۱۳۰-۱۳۲)، اما مصرف آنها به دلیل فعالیت باکتری کشی سریع آنها بخصوص در ترکیب با عوامل ضد دیواره سلولی، باعث تداوم استفاده کلینیکی آنها شده است.
این خانواده آنتی بیوتیکی، شامل عواملی هستند که با مهار سنتز پروتئین، باعث ازبین رفتن باکتری می گردند. در این میان، دستهای که توسط جنس استرپتومایسیس[۵۶] تولید میگردند با پسوند “mycins” و گروهی که توسط جنس میکرومونوسپورا[۵۷] تولید می‌شوند، به صورت”micins” نامگذاری میگردند. این آنتی بیوتیکها دارای بار الکتریکی مثبت (کاتیونیک) بوده و به شدت در آب محلول میباشند (۱۳۳). از اعضای این خانواده میتوان به آنتی بیوتیکهایی مثل جنتامایسین، استرپتومایسین، کانامایسین، نئومایسین، آمیکاسین، توبرامایسین و اسپکتینومایسین اشاره نمود که ساختار فضایی تعدادی از آنها در شکل ‏۰‑۱ تا شکل ‏۰‑۴ آورده شده است، همچنین نحوه اثر آنها به همراه سایر عوامل موثر بر سنتز پروتئین در جدول نشان داده شده است.
شکل ‏۰‑۱: ساختار فضایی استرپتومایسین
شکل ‏۰‑۲: ساختار فضایی کانامایسین
شکل ‏۰‑۳: ساختار فضایی آمیکاسین
شکل ‏۰‑۴: ساختار فضایی جنتامایسین

تاریخچه روند گسترش مقاومتهای آمینوگلیکوزیدی

نخستین مقاومت به دوزهای بالای آمینو گلیکوزیدی (HLAR) در سال ۱۹۵۹ و در قالب [۵۸]HLAR و در استافیلوکوکها مشاهده گردید (۱۳۴).
اما نخستین HLAR در میان انتروکوکها به صورت (Gentamicin Resistance High level HLGR) در انتروکوکس فکالیس و در فرانسه به سال ۱۹۷۹ میلادی مشاهده گردید (۱۳۵, ۱۳۶). از آنجا که تا سال ۱۹۸۶ هیچ شاهدی مبنی بر حضور HLGR در میان انتروکوکوس فاسیوم به چشم نمی خورد این فرضیه مطرح میگردد که مقاومتهای HLGR از انتروکوک فکالیس به انتروکوکوس فاسیوم انتقال یافته است (۱۳۷). که به کمک آزمونهای “in vitro” و انتقال موفق این مقاومت توسط Williams و Cgen این فرضیه تایید گردید (۱۳۵). در میان انتروکوکها، تا کنون گونههای متعددی ، مقاومتهای HLAR را نشان دادهاند که عبارتند از : E. casseliflavus, E. raffinosus, E. gallinarum, E. faecium, E. faecalis و E .avium در ادامه این مبحث، به مقوله اهمیت این نوع از مقاومتها و مشکلاتی که در پی خواهند داشت میپردازیم.

انواع مقاومت به آمینوگلیکوزیدها

مقاومتهای آمینوگلیکوزیدی میتواند به دلیل آنزیمهای تغییر دهنده[۵۹] تغییر در نفوذپذیری سلولی و یا تغییر در اهداف سلولی باشد (۱۳۸). انتروکوکها دارای دو تیپ متفاوت مقاومتی در برابر این خانواده آنتی بیوتیکی هستند:
مقاومتهای ذاتی (intrinsic)
مقاومتهای اکتسابی (acquired)
در این میان، مقاومتهای ذاتی که به واسطهی موتاسیونهای کروموزومی ایجاد می‌شوند، غیر قابل انتقال بوده اما مقاومتهای اکتسابی، پلاسمیدی یا ترانسپوزونی بوده و طبیعی است که این نوع مقاومت قابل انتقال می‌باشد.

مقاومتهای ذاتی

اغلب انتروکوکها به صورتی طبیعی به طیف وسیعی از آنتی بیوتیکها مثل سفالوسپورینها، اگزاسیلین، غلظتهای متداول کلینیکی کلیندامایسین و همین طور آمینو گلیکوزیدها مقاوم میباشند. مقاومتهای ذاتی در انتروکوکها میتواند به دلیل تغییرات در پروتئینهای دیواره سلولی خارجی، تغییرات در سیستم انتقالی فعال و یا تغییر اتصالات ریبوزومی می‌باشد (۱۳۹). از آنجا که جایگاه اصلی عمل آمینو گلیکوزیدها، ریبوزمهای باکتریایی می‌باشد، این داروها قبل از رسیدن به اهدافشان (ریبوزومها) باید از غشاء خارجی و سیتوپلاسمی باکتری عبور نمایند (۱۴۰). پس کاهش توانایی عبور از این موانع باعث مقاومت ذاتی به آمینو گلیکوزیدها میگردد (۱۴۱). همه انتروکوکها به دوز های پایین آمینوگلیکوزیدها(میکروگرم۴-۲۵۶) مقاوم هستند که نتیجه متابولیسم بی هوازی اختیاری در این باکتریها بوده که منجر به محدودیت جذب دارو میگردد.
همچنین انتروکوکوس فاسیوم دارای یک آنزیم استیل ترانسفراز کروموزمی ((AAC(6’) میباشند که باعث مقاومت به دوزهای بالای توبرامایسین، نتیل میسین و کانامایسین میگردد و همکاری درمانی میان آمینوگلیکوزیدها و عوامل ضد دیواره سلولی را کاهش میدهد (۱۴۲, ۱۴۳)

مقاومتهای اکتسابی

انتخاب و ماندگاری سویه‌های باکتریایی مقاوم به انواع آنتی بیوتیکها در میان میکروفلور نرمال انسان، به دلیل کاربرد نادرست این داروها در انسان بوده که میتواند به دلیل تجویز نامناسب و غلط آنتی بیوتیک، درمان ناقص و یا استفاده آنتی بیوتیکها بدون تجویز پزشک باشد، لذا ژنهای مقاومت آنتی بیوتیکی حفظ شده و توسط این میکروفلورهای نرمال به باکتریهای مولد بیماری منتقل میگردند (۱۴۴).
مقاومتهای اکتسابی غالباً به واسطه پلاسمیدها، ترانسپوزونها و یا اینتگرون ها منتقل میگردند و این قابلیت را دارند که در میان گونههای مختلف جنس انتروکوک پخش شده و یا حتی به سایر جنسها نظیر استافیلوکوکها و استرپتوکوکها، منتقل گردند (۷۹, ۱۴۵-۱۴۷). از جمله این مقاومتهای اکتسابی، میتوان به مقاومت نسبت به تتراسیکلین، اریترومایسین، کلرامفنیکل، مقاومت به دوزهای بالایتری متوپریم، کلیندامایسین و آمینو گلیکوزیدها اشاره نمود (۱۴۸). عموماً مقاومتهای اکتسابی در مقایسه با مقاومتهای ذاتی، سطح بالاتری از مقاومت را ایجاد مینمایند. در آمینوگلیکوزیدها، این مقاومتها، منجر به ایجاد [۶۰]HLAR میگردند (۱۴۵). مقاومتهای اکتسابی آمینوگلیکوزیدها عمدتاً به واسطه آنزیمهای تغییر دهنده آمینوگلیکوزیدها می‌باشد که باعث کاهش توانایی اتصال آنها به ریبوزومهای باکتری میگردد (۱۲۹, ۱۴۵)
به طور کلی آمینو گلیکوزیدها توسط سه گروه آنزیمی غیرفعال میگردند (۱۲۹):
AAC (استیل ترانسفرازها) که با استفاده از استیل – کوا باعث تغییر گروههای آمینی خاص در آمینو گلیکوزیدها می‌شوند.
ANT (آدنیل ترانسفرازها) که با استفاده از ATP، گروهای هیدروکسیل خاصی را آدنیله می‌کنند.
APH (فسفو ترانسفرازها) که با استفاده از ATP، گروههای هیدروکسیل ویژه ای را فسفریله می‌کنند.
محلهایی که غالباً تحت تاثیر این آنزیمها قر ار گرفته و دستخوش تغییر و تحول شده، در میان گروههای آمینی، شامل ۳ و ۲ و ۶ و در میان گروههای هیدروکسیل، شامل ۴ و ۳ و ۲ هستند.

اهمیت مقاومت آمینوگلیکوزیدی

از آنجا که آنتی بیوتیکهای موثر بر دیواره سلولی (Cell-wall active) همچون پنی سلینها، کارباپنم ها و گلیکوپپتیدها، به تنهایی فعالیت باکتریسیدال ناچیزی دارند (۹۶) در درمان عتفونتهای حاد انتروکوکی مثل باکتریمی، اندوکاردیت و مننژیت، رژیم درمانی که حاصل ترکیب این عوامل با آمینوگلیکوزیدها می‌باشد، توصیه می گردد (۹۶). لازم به ذکر است که روش درمانی که حاصل همکاری میان عوامل ضد دیواره سلولی و آمینوگلیکوزیدها به خصوص جنتامایسین می‌باشد، علاوه بر آنکه باعث افزایش و تسهیل جذب آمینوگلیکوزیدها به درون سلول میگردد، از گسترش موتانتهای مقاوم به جنتامایسین نیز ممانعت مینماید (۹۶). در این روش درمانی، آنتی بیوتیکهای ضد دیواره سلولی با سست نمودن دیواره منجر به افزایش نفوذ آمینوگلیکوزیدها به داخل سلول می‌شوند که به این ترتیب غلظت داخل سلولی این دسته از آنتی بیوتیکها بالاتر خواهد رفت و در زمان کوتاهتر، اثربخشی بهتری خواهند داشت (۹۶)
اما زمانی که مقاومتهای HLAR مشاهده میگردد، این روش درمانی نیز کارایی ندارد و به این ترتیب هیچ رژیمی درمانی معتبر و مطمئنی قابل توصیه نخواهد بود (Dressel et al., 1999). اهمیت موضوع زمانی آشکارتر میگردد که بدانیم این رژیمهای درمانی، علاوه بر درمان عفونت‌های انتروکوکی، به منظور درمان اندوکاردیتهای ایجاد شده توسط استرپهای آلفاهمولتیک، استافیلوکوکها و سایرباکتری ها هم استفاده می گردد (۹۶). متاسفانه پس از نخستین گزارشات در دهه ۱۹۷۰ مبنی بر جداسازی E. faecalis که دارای ویژگی HLAR بوده، تعداد عفونت های ایجاد شده توسط این عوامل روز به روز در حال افزایش بوده است به طوری که در حال حاضر E. faecalis با مقاومت HLAR گسترش جهانی یافته است(۹۶)
گسترش فراوانی HLR به آنتی بیوتیکها و از جمله آمینوگلیکوزیدها در میان انتروکوکها در مناطق مختلف دنیا، جامعه پزشکی را یک قدم به دوران پس از آنتی بیوتیکها (Postantimicrobial) نزدیکتر نموده است(۹۶). اما این نوع از مقاومتها علاوه بر اینکه باعث حذف تنها راه درمانی قابل اطمینان می گردد، مشکلات دیگری را نیز با خود به همراه خواهد آورد که در ادمه بحث به بررسی آنها می پردازیم.

ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﭼﻨﺪ داروﺋﯽ [۶۱]

ﻣﻘﺎوﻣﺘﻬﺎی آﻧﺘﯽ ﺑﯿﻮﺗﯿﮑﯽ ﮐﻪ در ﺑﺎﻻ ﺗﻮﺿﯿﺢ داده ﺷﺪه اﻧﺪ، ﻣﯽﺗﻮاﻧﻨﺪ ﺑﻪ ﻃﻮر ﻣﺴﺘﻘﻞ ﯾﺎ ﺑﻪ ﺻﻮرت ﺗﺮﮐﯿﺒﯽ در ﯾﮏ ﮔﻮﻧﻪ واﺣﺪ وﺟﻮد داﺷﺘﻪ ﺑﺎﺷﻨﺪ؛ ﺑﻮﯾﮋه ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﭘﻨﯽ ﺳﯿﻠﯿﻦ ﻧﺎﺷﯽ از اﻓﺰاﯾﺶ ﺳﻨﺘﺰ PBPﯾﺎ ﺑﺘﺎﻻﮐﺘﺎﻣﺎز ﮐﻪ ﺑﺎ ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﮔﻠﯿﮑﻮﭘﭙﺘﯿﺪﻫﺎ و ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺟﻨﺘﺎﻣﺎﺳﯿﻦ ﻫﻤﺮاه ﻣﯽﮔﺮدد. اﯾﻦ ﻣﻘﺎوﻣﺖﻫﺎی ﭼﻨﺪ داروﯾﯽ ﻣﻌﻤﻮﻻّ در اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓکالیس ﯾﺎﻓﺖ ﻣﯽﺷﻮﻧﺪ. ﻣﺴﺌﻠﻪ ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﭼﻨﺪ داروﯾﯽ انتروکوکها، ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﻣﻮاد ﺿﺪ ﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ دﯾﮕﺮی را ﮐﻪ در ﺣﺎل ﮔﺴﺘﺮش ﻫﺴﺘﻨﺪ ﻣﻄﺮح ﻣﯽﺳﺎزد. ﺑﻌﻨﻮان ﻣﺜﺎل اﺳﺘﺮﭘﺘﻮﮔﺮاﻣﯿﻦ دالفروپریستین ﺑﺮای درﻣﺎن ﻋﻔﻮﻧﺖﻫﺎی ﺟﺪی ﻧﺎﺷﯽ از اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓکالیس ﻣﻘﺎوم ﺑﻪ آﻧﺘﯽ ﺑﯿﻮﺗﯿﮑﻬﺎ اﺳﺘﻔﺎده می‌شود، وﻟﯽ ﻣﺘﺎﺳﻔﺎﻧﻪ گونه‌هایی ﮐﻪ ﺗﻮﻟﯿﺪ اﺳﺘﯿﻞ ﺗﺮاﻧﺴﻔﺮاز ﻣﯽﮐﻨﻨﺪ ﻗﺎدرﻧﺪ ژﻧﻬﺎیtetM ،tetL ، tetK را ﺗﻐﯿﯿﺮ دﻫﻨﺪ. ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﺗﺘﺮاﺳﺎﯾﮑﻠﯿﻦ از ﻃﺮﯾﻖ اﺳﺘﺮﭘﺘﻮﮔﺮاﻣﯿﻦ A، ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﻣﺎﮐﺮوﻟﯿﺪﻫﺎ از ﻃﺮﯾﻖ ژن ermو ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ ﮐﻠﺮاﻣﻔﻨﯿﮑﻞ از ﻃﺮﯾﻖ ژن catاﯾﺠﺎد می‌شود. ﺑﻌﻼوه ﺗﻌﺪادی از سویه‌های اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ ﻣﻘﺎوم ﺑﻪ ﺟﻨﺘﺎﻣﺎﺳﯿﻦ، ﺑﻪ ﺳﯿﭙﺮوﻓﻠﻮﮐﺴﺎﺳﯿﻦ ﻧﯿﺰ ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﻧﺸﺎن ﻣﯽدﻫﻨﺪ (۱۴۹).

HLAR و افزایش مرگ و میر (Mortality)

میزان مرگ و میر در میان بیماران مبتلا به باکتریمی ایجاد شده با سویه‌های انتروکوکس فکالیس که HLGR اند، بیش از مواردی است که توسط سویه‌های انتروکوکوس فکالیس حساس به جنتامایسین ایجاد می‌شوند. این میزان مرگ و میر، در مواردی که سویه‌های HLGR توأماً بتاهمولتیک نیز میباشند، افزایش می یابد. و در مواردی این ضریب افزایش حتی تا ۵ برابر هم گزارش شده است. علاوه بر انتروکوکها استرپتوکک های گروه G که بتاهمولتیک میباشند نیز ، HLAR مشکلات فراوانی ایجاد مینماید. نتایج حاصل از آزمون های کانجوگیشن نشان میدهد که فراوانی ودرصد انتقال پلاسمیدهای حامل ژنهای مقاومت به جنتامایسین توسط تیپهای بتا همولیتیک بیشتر میباشد چرا که این پلاسمیدها قابل انتقال به صورت همزمان توسط پلاسمیدهای بتاهمولیزین در این سویه ها میباشند (۱۵۰)
آمارها نشان میدهد که میزان سویه‌های HLGR بیش از HLSR است که به این ترتیب میزان مرگ و میر در سویه‌های HLGR نیز بیشتر از HLSR خواهد بود. درصد بروز سویه‌های HLGR در گزارشی حدود %۷۰ و در مواردی %۹۰ (۲۷) بوده است، اما در میان HLSR ها تنها حدود %۲۰ است(۱۵۱)
شکل ۱-۵- فلوچارت تشخیص انتروکوکوک به روش بیوشیمایی

PCR

در کارهای تشخیصی در آزمایشگاههای بالینی از روشهای مختلف PCR استفاده میگردد که این روش عبارتنداز (۱۹):